Ehrlichia,
pequeña bacteria Gram-negativa intracelular obligatoria, reside dentro
de vacuolas en el citoplasma de células sanguíneas de animales y
humanos. Se multiplica por fisión binaria, formando un agregado o
microcolonia ("mórula"), visible en frotis sanguíneo al microscopio
óptico. Transmitida por garrapatas, causa una enfermedad llamada
ehrlichiosis. En Estados Unidos se ha descrito Ehrlichia monocitotrópica en el año 1987, y Ehrlichia granulocitotrópica en 1994 y 1999. En Venezuela no fue sino hasta 1994 que por vez primera se identificó un agente de Ehrlichia con característica trombocitotrópica
en frotis de sangre humana. Se presenta una casuística de un grupo de
individuos que por diferentes motivos solicitaron la realización del
examen. Se revisaron 182 frotis sanguíneos (periférica y capa blanca)
coloreados con Wright. Se identificaron mórulas intraplaquetarias de Ehrlichia en 68 de los 182 (37,36%) sujetos estudiados.
Palabras-clave: Ehrlichia, ehrlichiosis trombocítica humana, plaquetas.ABSTRACT
Ehrlichia
is a small obligatory intracellular and Gram-negative bacteria that
grows within a cytoplastic vacuoles in animals and human blood cells. Ehrlichia multiplies
by binary fision originating a microcolonies or aggregates named
"morulae", visible in blood smear with optic microscope. Transmitted by
ticks, cause an illness named ehrlichiosis. By 1987, monocytic Ehrlichia was described in USA and granulocytotropic Ehrlichia by 1994 and 1999. In Venezuela, an Ehrlichia agent
with trombocytotropic characteristic was reported first by 1994 in
human blood smear. It is reported the data of a group of subjects that
for different reasons asked for the exam. 182 blood smears (peripheral
and buffy coat) stained with Wright were studied. Intraplatelet Ehrlichia morulae were identified in 68 of 182 studied subjects (37,36%).
INTRODUCCIÓN
Agente etiológico.
El
agente etiológico de la ehrlichiosis es una bacteria intracelular
obligatoria, Gram-negativa, de forma cocoidal, que requiere de un
mamífero como reservorio y de un artrópodo como vector. Presenta
tropismo por células sanguíneas (leucocitos y plaquetas) de animales y
humanos, e invade su citoplasma, alojándose dentro de vacuolas, donde se
multiplica por fisión binaria, dando origen a un agregado de la
bacteria o microcolonia, que por su apariencia se ha denominado
"mórula".
Vector.
La penetración del microorganismo Ehrlichia
en el individuo se origina a través de la saliva de la garrapata
infectada, que contamina el sitio de la picada, en el momento de su
alimentación con sangre humana. Su presencia en las glándulas salivares
así lo confirma. La transmisión es transestadial; lo que significa que
durante el estado de larva, ninfa o adulto (macho o hembra) de la
garrapata, están en capacidad de transmitir la enfermedad. No se
presenta transmisión transovárica; esto quiere decir que durante la
etapa del desarrollo dentro del vector, la bacteria no pasa al embrión,
por lo que no es transmitida al hospedero por la siguiente generación.
La ausencia de Ehrlichia detectable en los ovarios de la
garrapata destaca que la transmisión transovárica no es el mecanismo de
mantenimiento de esta bacteria en la naturaleza. La transmisión de ese
agente requiere que la duración de la picada sea lo suficientemente
prolongada (24 a 48 horas). La garrapata, al picar, puede transmitir
otros microorganismos que, al igual que Ehrlichia, conducen a otras enfermedades en el humano, como son la babesiosis, la encefalitis equina y la enfermedad de Lyme (1-6).
Taxonomía.
La
clasificación taxonómica de este microorganismo ha experimentado
variaciones a medida que se profundiza en su estudio. Actualmente,
basados en el análisis de la secuencia genética del 16S del ARN
ribosomal y el operón groESL, reforzada por características biológicas y antigénicas, se ha presentado una nueva reorganización de los miembros de la tribu Ehrlichieae,
por lo que los cinco patógenos de humanos descritos de esta bacteria se
encuentran incluidos en tres de los cuatro géneros (genogrupos) que
conforman la familia Anaplasmataceae (7).
Orden Rickettsiales
Familia Anaplasmataceae
Tribu Ehrlichieae
1. Genogrupo Ehrlichia, conformado por :
- Ehrlichia chaffeensis,
- Ehrlichia ewingii,
- Ehrlichia canis,
- Ehrlichia muris y
- Cowdria ruminantium.
2. Genogrupo Anaplasma, constituido por:
- Anaplasma (Ehrlichia) phagocytophilum: (E. phagocytophila, E. equi, Agente de la HGE);
- Anaplasma (Ehrlichia) platys,
- Anaplasma (Ehrlichia) bovis y
- Anaplasma marginal.
3. Genogrupo Neorikettsia, integrado por:
- Neorickettsia (Ehrlichia) sennetsu,
- Neorickettsia (Ehrlichia) risticii y
- Neorikettsia helminthoeca.
Signos y síntomas.
Los
síntomas más frecuentes reportados son: fiebre, escalofríos, cefalea,
mialgias, malestar general, náuseas, anorexia, pérdida de peso y
erupción. Pueden surgir complicaciones graves, como insuficiencia renal,
insuficiencia respiratoria, alteración del sistema nervioso central,
hemorragias, vasculitis, uveítis, entre otras. También se pueden
presentar leucopenia, trombocitopenia y elevación de transaminasas
séricas (8, 9).
Diagnóstico.
Debido
a que en la actualidad no se cuenta con pruebas de laboratorio rápidas y
accesibles, aparte de la visualización de las mórulas en frotis
sanguíneos, el diagnóstico se fundamenta en características
epidemiológicas y clínicas para una rápida administración del
tratamiento, por lo que puede ser confundida esta entidad con otras
enfermedades de similar sintomatología. Así, cualquier paciente febril
proveniente de una zona endémica con exposición a garrapatas debe ser
considerado como posible ehrlichiosis para aplicar tratamiento temprano.
Así mismo, casos de sujetos con trombocitopenias y leucopenias deben
ser cuidadosamente estudiados y tratados, aún estando aparentemente
asintomáticos.
Tratamiento.
Los
datos mas convincentes, por experiencias clínicas registradas,
establecen como droga de elección la doxiciclina, observándose una
respuesta rápida a las 24 a 48 horas (6, 10).
Antecedentes históricos.
La ehrlichiosis humana, enfermedad descrita inicialmente en animales y recientemente en humanos, es producida por una bacteria, Ehrlichia,
llamada así en memoria al recordado bacteriólogo alemán Paul Ehrlich,
que además fue creador de un colorante triácido que permitió diferenciar
los leucocitos en frotis fijados de sangre según sus características
nucleares y citoplasmáticas (lo que dio comienzo a la era de la
hematología morfológica), siendo usado para el diagnóstico directo de
este microorganismo en estudio (11).
En abril de 1986, fue reconocida la ehrlichiosis en los Estados
Unidos de Norte América (EUA), en un individuo de 51 años con signos
clínicos similares a la Fiebre Manchada de las Montaña Rocosas. El
paciente presentó fiebre, dolor de cabeza, mialgias, artralgias,
náuseas, identificándose agregados bacterianos o microcolonias
denominadas mórulas de Ehrlichia en el citoplasma de monocitos.
Se confirmó la asociación con exposición a garrapatas (12). Anterior a
esa fecha, en 1954, se había descrito en Japón un caso de ehrlichiosis
monocítica humana en un individuo de 25 años, quien presentó
sintomatología semejante a mononucleosis infecciosa; se la denominó
Fiebre Sennetsu (13). La enfermedad se caracterizó por fiebre asociada a
la observación microscópica de mórulas ubicadas en el citoplasma de
leucocitos mononucleares circulantes. En el año 1991, también en EUA, se
aísla y caracteriza el agente etiológico de la ehrlichiosis monocítica
humana, designándosela posteriormente como Ehrlichia chaffeensis.
(14, 15). En 1994 se describió otra nueva enfermedad infecciosa, que se
designó como ehrlichiosis granulocítica humana (HGE), debido a que las
mórulas se localizaron en el citoplasma de granulocitos circulantes, en
la actualidad clasificada taxonómicamente como Anaplasma (Ehrlichia) phagocytophila (16). En 1999, nuevamente en EUA, se identificó otro agente, Ehrlichia ewingii, conocido en el campo veterinario, que también puede causar ehrlichiosis granulocítica en humanos (17).
Los primeros cinco estudios de ehrlichiosis en Venezuela.
1. A comienzo del año 1994 se publicó un trabajo de investigación titulado "Ehrlichiosis en animales y humanos en Venezuela",
donde se analizaron 103 muestras de sangre, identificándose el
microorganismo en el citoplasma de plaquetas humanas como también en el
de caninos, donde se encontró una positividad del 45% en el grupo de
humanos estudiados que expresaron mantener estrecho contacto con
animales y garrapatas (18).
2.
A finales de 1994 se publicó una revisión bibliográfica extensa de
ehrlichiosis en humanos escrita en Venezuela. No se mencionó
identificación de mórulas de Ehrlichia en sangre humana en nuestro país para esa fecha (19).
3. En 1996 se publicó el trabajo titulado "Ehrlichiosis humana: reporte del primer caso en Venezuela" (20).
4. En 1996 se publicó el trabajo "Identification of Ehrlichia Specie in Blood Smear" (identificación de especie de Ehrlichia en frotis sanguíneo), donde nuevamente se ratifica que la especie de Ehrlichia
estudiada es predominantemente específica de plaquetas; además, incluye
un estudio de microscopía electrónica en muestra de sangre canina con
ehrlichiosis en fase aguda. Se presentó la ultraestructura de la
bacteria trombocitotrópica canina (21).
5. En 1996 se reportó infección asintomática por agente semejante a Ehrlichia canis en un hombre venezolano. Se aísla y realiza caracterización antigénica y genética del agente (22).
En
el año 2002, se publicó en Venezuela un trabajo de investigación, en el
cual se detecta la presencia en sangre humana del ADN del
microorganismo, diagnosticado morfológicamente como Ehrlichia trombocítica,
utilizando la prueba de reacción en cadena de la polimerasa (PCR),
observándose una migración electroforética igual a la de Ehrlichia platys, conocido agente de ehrlichiosis trombocítica canina en el campo veterinario (23).
OBJETIVO
El
propósito de este trabajo fue presentar resultados de la casuística
acumulada del estudio de ehrlichiosis en humanos, desde su inicio en
octubre de 1993 hasta febrero de 2004, exclusivamente en individuos a
los que se recomendó solicitar la realización del examen, bien sea por
exposición a garrapatas o por mantener contacto con animales, estando
algunos aparentemente asintomáticos y otros con sintomatología de
intensidad variable compatible con ehrlichiosis. Algunos pacientes que
presentaron sintomatología de la enfermedad expresaron no poseer
animales ni recordaron haber sido picados por garrapatas.
MATERIALES Y MÉTODOS
Desde
su inicio, en octubre de 1993, hasta febrero de 2004, se han estudiado
182 muestras de sangre humana (con rango de edad que va desde 1 a 84
años, provenientes de sujetos a los que se recomendó solicitar la
realización del examen.
El
diagnóstico morfológico se realizó mediante revisión de frotis
sanguíneos (sangre periférica y capa blanca concentrada), coloreados con
Wright, utilizando microscopio de excelente óptica con cámara
fotográfica adaptada.
Se
utilizaron 5 ml de sangre extraída con anticoagulante Ethylenediamine
tetraacetate (EDTA), elaborándose frotis de sangre periférica (marcados
A). Luego se procedió a hacer los frotis de capa blanca concentrada
(marcados B), para lo cual se esperó a que ocurriera la sedimentación
espontánea de los eritrocitos (temperatura ambiente), por espacio de
pocos minutos. Una vez ocurrida, se trasvasó la capa blanca (con
abundantes leucocitos y plaquetas) a un tubo Eppendorf (1,5 ml), se
centrifugó por 5 minutos para concentrar los leucocitos y plaquetas y se
descartó el plasma, realizándose frotis en laminilla (cubreobjetos
libre de grasa y pulida) con una fracción del sedimento "sin
resuspender". Los frotis fijados y coloreados con Wright se montaron
sobre portaobjetos, utilizando resina para su conservación y archivo. El
tiempo de acción del colorante estuvo cuidadosamente ajustado y bien
estandarizado, lo que evitó la sobrecoloración de los elementos,
principalmente de los gránulos plaquetarios. Se buscó el sitio ideal en
el frotis que mostraba una mejor distribución y coloración de los
elementos. A veces, la tinción es mas intensa de un lado del frotis que
del otro. Las extensiones sanguíneas se revisaron meticulosamente con
objetivo de inmersión, familiarizándose inicialmente con lo que es
normal y lo que es anormal. Cada paciente tiene sus particularidades
hematológicas que fueron reconocidas y analizadas.
RESULTADOS
Se
analizó un total de 182 muestras de sangre, 120 del sexo femenino y 62
del sexo masculino, para la búsqueda del microorganismo mediante la
revisión de frotis de sangre periférica (A) y frotis de capa blanca
concentrada (B). Dentro del total estudiado habían 34 muestras de niños.
Los resultados del estudio se presentan en la tabla 1, donde se muestra la frecuencia con que se detectó las mórulas de Ehrlichia, 68 de las 182 muestras analizadas (37,36%). La localización de la mórula fue intraplaquetaria en todos los casos (ver figuras 1 y 2). No se encontraron mórulas en leucocitos.
Figura 1. Microfotografía de frotis de capa blanca concentrada en zona de abundantes plaquetas, donde se aprecia mórula de Ehrlichia en plaqueta (ver flecha). Se observan también tres células mononucleares. (x 1.000).
Figura 2. Microfotografía de frotis de capa blanca concentrada en zona de abundantes plaquetas, donde se aprecia mórula de Ehrlichia en plaqueta (ver flecha). A la derecha se observa un linfocito. (x 1.000).
El rango de
edad de los 68 pacientes con infección ehrlichial estuvo entre 1 y 84
años con un promedio de 32,32 años, agrupados según la edad, como se
muestra en la tabla 2. Se observa que el mayor número de casos positivos corresponden al grupo de edad comprendida entre 21 y 40 años (51,47%).
Según el sexo,
de 120 muestras procesadas pertenecientes al sexo femenino, se
encontraron positivas 47 de ellas (39,17%). Por otro lado, de 62
muestras de sexo masculino, fueron positivas 21 (33,87%) (ver tabla 3).
Del total de
las 182 muestras estudiadas, 34 pertenecían a niños. Se identificó la
bacteria en 11 muestras infantiles (32,35%), 9 de las 24 del sexo
femenino (37,5%+) y 2 de 10 del sexo masculino (20%) (ver tabla 4).
Tabla 4. Resultados de la identificación de mórulas de Ehrlichia en pacientes menores de 12 años, según sexo.
Los casos
positivos estudiados se presentaron en todos los meses del año, excepto
diciembre. El mayor número se ubicó en el mes de febrero (ver tabla 5).
En la actualidad, en nuestro continente, según la literatura internacional revisada se describe un primer tipo de infección por Ehrlichia en humanos, producida por un agente monocitotrópico o monocítico que permanece taxonómicamente ubicado en el género Ehrlichia,
y fue reportado por primera vez en EUA por Maeda y colaboradores en
1987. Un segundo tipo de infección ehrlichial descrito es causado por un
agente granulocítotrópico o granulocítico, recientemente ubicado en el
género Anaplasma, identificado por Chen y su equipo, también en EUA en 1994 y por otro, Ehrlichia ewingii, también con característica granulocitotrópica, conocido en el campo veterinario (12, 16, 17).
En Venezuela se publicó, en 1994, un trabajo pionero de ehrlichiosis en animales y humanos, causada por una especie de Ehrlichia
trombocitotrópica o trombocítica. Esto representa un tercer tipo de
agente causante de infección. En dicho trabajo se analizaron 103
muestras de sangre, evidenciándose diferencias significativas entre los
tres grupos estudiados: 1) perros que fueron llevados a clínicas
veterinarias, con 32% de positividad; 2) personas que mantienen contacto
estrecho con garrapatas y animales con ehrlichiosis, con 45% de
positividad; y 3) personas que manifestaron no tener contacto con
animales o garrapatas, con 0% de positividad (grupo control). Estos
resultados motivaron la continuación del estudio de este microorganismo
(18).
En ese primer trabajo (1994) se reportó algo novedoso: las mórulas de Ehrlichia
identificadas se encontraron ubicadas en el citoplasma de plaquetas.
Desde entonces se ha estado reportando este agente, con características
de invasor de plaquetas, en todos los casos analizados. Hasta el
presente se han estudiado 182 muestras, de las cuales 68 arrojaron
resultado positivo, identificándose la especie invasora de plaquetas.
Entonces, cabría preguntar ¿será la misma Ehrlichia platys de caninos que infecta al humano o será una especie especifica de humanos, no caracterizada aún?
Un trabajo publicado en 1996 en nuestro país (20), erróneamente titulado "Ehrlichiosis humana: reporte del primer caso en Venezuela",
en el cual se hace mención de un caso observado en el año 1992 en una
niña de 17 meses, identifica cuerpos de inclusión en plaquetas
semejantes a los observados en perros, y que corresponde a Ehrlichia platys.
Este hallazgo no fue reportado en su momento (1992), sino años mas
tarde (1996), cuando ya había una primera publicación de otro autor, con
la misma descripción de mórulas en plaquetas humanas semejantes a Ehrlichia platys de caninos (18).
En
la literatura internacional revisada no se encontró otro reporte en el
que se haya identificado, en sangre humana, mórulas de Ehrlichia
trombocitotrópica. Por esto no se pudo comparar resultados. Sin embargo,
se encontró que, en 1978, Harvey y colaboradores publicaron un trabajo
en caninos donde se presentan las manifestaciones hematológicas y la
ultraestructura de un microorganismo rickettsial específico de
plaquetas, aislado de un perro en Florida, EUA, que induce una
trombocitopenia cíclica Este microorganismo descrito por Harvey es el
que se identificó predominantemente en la sangre de los caninos
estudiados en Venezuela, mostrando la misma ultraestructura al
microscopio electrónico, siendo también semejante al que observamos en
plaquetas humanas en microscopio de luz (18, 21, 24).
En
la actualidad, diferentes laboratorios en el mundo dedicados a la
investigación de este microorganismo implementan métodos que facilitan
el estudio de un número grande de muestras, lo que permite conocer
género y especie. Sin embargo, hasta ahora, el único método de
diagnóstico específico confiable, económico y disponible en Venezuela es
la identificación directa del microorganismo por visualización de
mórulas en frotis sanguíneo coloreado con Wright. La sensibilidad
de este método depende forzosamente de un microscopio de excelente
óptica, de la calidad del frotis, del tiempo consumido en examinar el
extendido, de la inmunocompetencia del paciente, tipo de tropismo que
presente el agente infeccioso y, muy especialmente, de la experiencia
del profesional que realiza la búsqueda. Así, se ha reportado que en el
50% de pacientes con HGE se han descrito inclusiones intracitoplásmicas
en neutrófilos (8); en monocitos es menos frecuente: del 7 al 17% de
casos (25). En nuestra primera publicación detectamos presencia de
mórulas en plaquetas en el 45% de humanos que mantienen contacto
estrecho con garrapatas (18)
Es
lógico pensar que el grado de dificultad para encontrar las mórulas en
el campo del microscopio depende principalmente del número y tamaño de
la célula sanguínea en circulación, por lo que resulta mas fácil
encontrarlas en plaquetas, en comparación con granulocitos y monocitos,
ya que estos últimos se presenta en cantidad reducida en circulación, en
condiciones normales. Recordando la cuenta diferencial relativa en
porcentaje (%), la concentración absoluta (célula/lt.) y tamaño de las
células (diámetro) en sangre periférica circulante del adulto, nos da
una idea de como la identificación de mórulas en plaquetas esta
favorecida por este hecho (26) (ver tabla 6).
De acuerdo a esto, el grado de dificultad para encontrar las mórulas se podría representar de la siguiente manera:
Esto significa que es más difícil encontrar mórulas en el monocito que en la plaqueta.
Además,
facilita la visualización de la mórula en el citoplasma plaquetario el
hecho de que el trombocito es una célula anucleada, a diferencia de los
granulocitos y monocitos, que son células con núcleo y con capacidad
fagocítica, por lo que pueden internalizar restos celulares u otros
cuerpos que reconozcan como extraños, lo que dificulta y confunde la
identificación de la mórula.
Después
de la centrifugación de la capa blanca, y en base al peso molecular de
cada tipo de células sanguíneas, al realizar el extendido, éstas se
ubican en zonas particulares en el frotis (zona de ubicación plaquetaria
y zona de ubicación leucocitaria). Esta distribución de los elementos
facilitó la búsqueda del microorganismo, por lo que fue fundamental en
la metodología.
Algunos pacientes presentaron una marcada alteración del tamaño de las
plaquetas, en ocasiones más grandes que un monocito. Cabría preguntarse
si esto ocurre por liberación temprana a sangre circulante. Las
plaquetas no pueden regenerar membranas, no poseen maquinaria para
sintetizarla de nuevo, por lo que podría pensarse ¿adquieren ese gran
tamaño dependiendo del número de microorganismos que se desarrolla en
su interior?
Queda
sin dilucidar cuál será el mecanismo de penetración de la bacteria en
la plaqueta. No siendo ésta una célula fagocítica, ¿cuál sería entonces
el tipo de receptor, a nivel de membrana, que permite la endocitosis del
microorganismo?
Las
plaquetas aparecen en frotis de sangre periférica normal como
estructuras granulares pequeñas que circulan como células anucleadas
discoides, con diámetro aproximado de 2 a 3 µm. Algunos pacientes
mostraron plaquetas con citoplasma agranular, no pudiéndose explicar el
porque de la pérdida de esos gránulos (ver figura 3).
Figura
3. Microfotografía de frotis de sangre periférica. La flecha muestra
una plaqueta agranular (plaqueta fantasma). Arriba a la izquierda,
plaqueta con pequeña mórula. Coloración de Wright (x1000).
Los gránulos de
las plaquetas son muy finos, y se distribuyen homogéneamente. Algunos
pacientes presentaban, además de estos gránulos finos, otros gránulos
gruesos no frecuentes de ver en plaquetas normales, los cuales podrían
ser cuerpos elementales (ver figura 4).
Figura
4. Microfotografía de frotis de capa blanca concentrada en zona de
abundantes plaquetas, donde se aprecia plaqueta de gran tamaño (ver
flecha) con gránulos gruesos atípicos (probables cuerpos elementales).
Arriba, linfocito. Coloración de Wright (x1000).
Se
consideró la posibilidad de observar infección mixta con otros
microorganismos transmitidos por garrapatas, como se apreció en estudio
realizado anteriormente (y cuyos datos no fueron publicados en su
oportunidad), donde en 100 caninos callejeros estudiados se detectó un
65% de infección única por Ehrlichia platys, el 19 % presentaban infección mixta por Ehrlichia platys y Babesia canis, el 3% presentó infección sólo por Babesia canis y en el 1% se observó microfilarias (21).
Se
observó con frecuencia, en el frotis de capa blanca de sujetos con
presencia de mórulas intraplaquetarias, alteraciones de los elementos
formes de la sangre, como células irritativas, linfoplasmocitos,
plasmocitos, plasmocito con cuerpos de Russell, monocitos vacuolados,
monocitos y neutrófilos con plaquetas fagocitadas, células parcialmente
destruidas repletas de plaquetas fagocitadas, eritrofagocitosis,
leucofagocitosis, presencia de megacariocitos, plaquetas gigantes,
plaquetas agranulares, plaquetas con gránulos gruesos atípico, algunos
eritrocitos con punteado basófilo
Ha sido demostrado que Ehrlichia puede sobrevivir en productos sanguíneos, incluyendo bolsas de células rojas, refrigeradas entre 4 - 6°C, por varios días (27).
Hay evidencias de anticuerpos antiplaquetarios en modelo canino con ehrlichiosis aguda (28).
CONCLUSIÓN• En la bibliografía internacional consultada no se encontró reportes de Ehrlichia invasora de plaquetas de sangre humana; éste podría ser el primero.
• Se detectó la presencia de mórulas de Ehrlichia trombocitotrópica en 68 de las 182 muestras analizadas (37,36%). No se identificó mórula en leucocitos.
• El mayor número de casos positivos correspondió al grupo de edad comprendida entre 21 y 40 años (51,47%).
• Se evidenció mayor número de casos positivos en el sexo femenino (39,17%), mientras que en el sexo masculino fue de 33,87%.
• Se presentó un 32,35% de positividad en los niños estudiados.
•
Los casos positivos estudiados se presentaron en todos los meses del
año, excepto diciembre, siendo más numerosos en el mes de febrero.
AGRADECIMIENTO
A
mi hija, Irene Tamí Maury, odontóloga, MSc, quiero expresar mi
reconocimiento por su valiosa ayuda, en todo momento, desde el inició de
este trabajo de investigación.
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