LYME. CONSENSOS .

http://consensos.org/protocol/sero09.htm

HISTORIA NATURAL DE LA ENFERMEDAD
La enfermedad de Lyme puede ser subclínica o tener un amplio rango de manifestaciones clínicas. En todos los casos, debe haber habido un riesgo de exposición a garrapatas. El antecedente de picadura de garrapata no es imprescindible, ya que puede pasar inadvertido o no relacionarse con el proceso que puede comenzar semanas o meses después. Por este motivo, la notificación por parte del paciente de picadura previa es poco habitual en muchos países y no es un criterio necesario de inclusión.
El curso clínico de esta enfermedad es altamente variable. Además, hay casos que presentan manifestaciones tardías sin haber pasado por las fases previas. Comienza, en la forma típica, durante la denominada de fase localizada temprana, con una lesión que se va diseminando desde el lugar de la inoculación (eritema migrans, EM), y que es característica de esta enfermedad. Su variabilidad puede dificultar su correcta identificación. El tiempo de incubación es variable (2-30 días). Lesiones más tempranas pueden ser debidas a reacciones frente a la picadura o infecciones bacterianas secundarias a la misma. En algunos pacientes con piel más pigmentada o con lesiones en lugares de difícil localización esta fase puede diagnosticarse con mayor dificultad. Si existen otros síntomas como son adenopatías, artralgias, mialgias etc. es probable que ya se haya producido una diseminación temprana de espiroquetas a otros órganos. Otro tipo de lesión poco frecuente pero posible en esta fase es el linfocitoma, más frecuente en niños, y con una localización preferencial en lóbulo de oreja, pezón y escroto.
Más adelante, segundo estadío, se desarrollarán las manifestaciones neurológicas y articulares tempranas, cardíacas ( mucho menos frecuentes), cutáneas diseminadas y, meses o años después, la afectación articular y neurológica de curso crónico (menos frecuente), con una pauta secuencial y periodos intermedios de latencia.
La triada clásica de la forma neurológica de la fase diseminada temprana incluye meningitis linfocitaria, neuropatía craneal (con el resultado más frecuente de parálisis facial) y radiculoneuritis, tanto solas como en combinación. La meningitis, normalmente aguda, puede recidivar, con periodos de remisión intermitentes e incluso evolucionar, en pacientes no tratados, a cuadros crónicos de difícil resolución. La radiculoneuritis - síndrome de Garin-Bujadoux-Bannwarth es, junto con el eritema migrans, una de las manifestaciones características de esta enfermedad - puede resolverse espontáneamente en 5 o 6 meses con una evolución clínica posterior variable. Los hallazgos en el líquido cefalorraquídeo (LCR) muestran pleocitosis linfocitaria de células plasmáticas. La síntesis intratecal de anticuerpos es un marcador constante en la mayoría de estos casos. Esta manifestación cursa con cefalea y pueden aparecer mialgias, artralgias y fatiga. Las neuropatías craneales y radiculo neuritis pueden aparecer como manifestación única de esta fase, siendo los nervios craneales los más frecuentemente afectados. El LCR puede ser normal o mostrar signos de pleocitosis. En general, en esta fase la fiebre suele ser suave o no estar presente. Síntomas acompañantes pueden ser los típicos de una gripe. Otras manifestaciones observadas incluyen encefalitis, ataxia y mielitis aguda. La duración de estos síntomas es variable. Durante esta segunda fase se ha descrito, de forma menos frecuente, una afectación cardíaca en forma de bloqueo atrioventricular de grado II-III, además de endomiocarditis y pericarditis. Su evolución a la cronicidad en forma de miocardiopatía dilatada de larga duración no está confirmada y hay autores que la discuten. También se han descrito menos frecuentemente uveitis anterior y posterior, panoftalmitis, hepatitis, miositis y orquitis.
La tercera fase, o fase diseminada tardía, es poco frecuente.
En su forma de neuroborreliosis puede existir afectación del sistema nervioso periférico o del sistema nervioso central (SNC). La primera puede presentarse en aproximadamente dos tercios de los pacientes no tratados y frecuentemente se asocia a casos con afectación cutánea crónica (acrodermatitis crónica atrofica -ACA). Consiste en una neuropatía periférica que suele aparecer en las zonas de lesión cutánea. Los valores del LCR pueden ser normales.
La afectación del SNC aparece entre meses y años después del inicio, como una encefalomielitis crónica. La lejanía del brote inicial complica el correcto diagnóstico de estos casos. Normalmente no se resuelve espontáneamente y produce pérdida de memoria, depresión, polineuropatía sensorial o paraparesia espástica. El LCR muestra pleocitosis mononuclear y síntesis intratecal de anticuerpos. La afectación articular, que parece poco frecuente en Europa, puede empezar en la fase temprana, con ataques de oligoartritis intermitente, puede evolucionar a artritis permanente con erosión del cartílago o hueso en los casos graves (se ha asociado la presencia de artritis de Lyme con fenotipos HLA-DR2 o DR4, sugiriendo un factor inmunogenético en su patogénesis). El nivel de anticuerpos específicos en suero y líquido sinovial (LS) debe ser, generalmente, alto en la fase crónica. Consecuentemente, un enfermo con artritis crónica y resultados serológicos negativos o equívocos probablemente no es, salvo deficiencias inmunes concretas, un enfermo de BL. En general la presencia de artralgias, mialgias o fibromialgias, sin otros síntomas asociados, no están aceptados como criterios de inclusión.

DIAGNOSTICO DE LABORATORIO

Normalmente, no hay hallazgos específicos en sangre periférica. La velocidad de sedimentación puede ser normal o estar ligeramente elevada, al igual que el recuento de células blancas. Sin embargo en las fases tempranas de neuroborreliosis, el LCR debe, normalmente, mostrar una pleocitosis linfocitaria moderada y proteínas elevadas con niveles normales de glucosa. La presencia de bandas oligoclonales específicas en LCR es un hecho común y apoya el diagnóstico. Sólo en casos de neuropatías periféricas el LCR puede ser normal. En casos crónicos, la presencia de pleocitosis linfocitaria es esencial, siendo la presencia de bandas oligoclonales y de IgG total elevada hallazgos frecuentes.

DIAGNOSTICO SEROLOGICO

La determinación de anticuerpos específicos está condicionada por las características expuestas anteriormente. La similitud entre determinantes antigénicos de este grupo de microorganismos y proteínas muy conservadas en otras especies bacterianas y virales, además de las reacciones cruzadas con proteínas humanas dificultan la obtención de resultados con un valor predictivo positivo aceptable si se utiliza una única técnica serológica para el diagnóstico de esta enfermedad. Por este motivo es imprescindible el uso de un esquema diagnóstico de dos tests, uno de alta sensibilidad para screening (ELISA o inmunofluorescencia), donde obtendremos resultados positivos con una especificidad baja, y otro de confirmación (Inmunoblot -IB), que nos permitirá alcanzar un nivel de especificidad mayor de un 98% si se confirman todos los resultados positivos o equívocos obtenidos en el muestreo inicial.
En la Tabla 1 se muestra un resumen esquemático de los criterios diagnósticos según la fase de la enfermedad.

Screening.

Para el muestreo hay una gran variedad de técnicas comerciales disponibles. Varían tanto en la genoespecie (actualmente existen en el mercado pruebas inmunoenzimáticas con las tres genoespecies) como en la fracción antigénica utilizada, lo que conduce a grandes diferencias en sensibilidad (con descripciones de entre un 50 y un 93.8%).
Por lo general, un esquema que incluya un sonicado de células completas como antígeno en un ELISA indirecto va a tener una buena sensibilidad. Hay laboratorios que añaden técnicas alternativas tales como un ELISA con proteínas del flagelo obtenidas por fraccionamiento celular o con fragmentos recombinantes de los principales antígenos inmunodominantes de las genoespecies.
Nuestros datos indican que la elección de un ELISA basado en antígenos individuales (como el ELISA-flagelo) debe ser cuidadosamente evaluada, ya que se ha descrito una variabilidad apreciable entre las cepas de las diferentes "areas endémicas" aún dentro del mismo país; esto supone que idéntico ELISA con un determinado antígeno flagelar puede no presentar la misma sensibilidad en todas aquellas, subestimando el diagnóstico de la enfermedad especialmente en las fases tempranas de la misma. Los datos disponibles hasta la fecha sobre distribución de genoespecies en España muestran una mayor frecuencia de aislamientos de B. garinii, seguida de B. burgdorferi. No ha habido hasta la fecha notificación de cepas de B. afzelii, aunque hay sospechas de su participación en casos de ACA, manifestación clínica generalmente asociada con esta genoespecie. Se recomienda una determinación tanto de anticuerpos IgG como IgM por separado aunque, dependiendo de la fase en la que esté el paciente, la ausencia de IgM no descarta una enfermedad activa. Igualmente, la genoespecie empleada en este test puede tener influencia en su sensibilidad.
Este problema, y en general los problemas que determinan una sensibilidad baja en el screening, se puede solventar modificando los valores de corte del test de acuerdo con las características de la población en estudio y en cualquier caso, no se han descrito todavía métodos enzimáticos que puedan evitar la necesidad de confirmación por IB.
En resumen, aunque la variedad de los ELISA disponibles en el mercado hace muy difícil su estandarización, la modificación local de los valores de corte y el esquema de confirmación por IB de todas las muestras con resultado positivo o equívoco puede obviar esas diferencias.En los casos neurológicos con afectación del SNC es necesaria la confirmación de producción intratecal de anticuerpos mediante estudio del índice de IgG/albúmina. Sin embargo y dado que en esta fase es frecuente una permeabilidad patológica de la barrera hematoencefálica un índice no significativo no descarta tampoco la enfermedad.

Confirmación.

El IB es una técnica imprescindible en la serología de la BL y el empleo de la genoespecie apropiada es vital para su correcta interpretación. La falta de estandarización y adecuación de cepa para la fabricación de este test es la causa de los grandes problemas de discordancia entre laboratorios. En general, las recomendaciones para la interpretación de un IB deben estar siempre adaptadas al medio donde se realice esta técnica, mediante el empleo de la/las genoespecie/s circulantes. Se recomienda el empleo de cepas de pase bajo (con la mayoría de las proteínas intactas) y que expresen OspC (hay mucha variabilidad en este punto y OspC es una de las proteínas vitales para la interpretación de un IB). Por todos estos motivos, es difícil la definición de criterios de interpretación internacionales. En España y con los datos disponibles hasta la fecha sobre la distribución de cepas las genoespecies que deberían emplearse en un IB son B. garinii y B. burgdorferi.
Entre las recomendaciones aceptadas hasta la fecha (Tabla 2, refs. 5 y 6) para la interpretación de IB-G y IB-M y las publicadas por centros de nuestro entorno (Tabla 2, ref. 4) hay grandes diferencias. En general, los criterios europeos son más laxos, lo que implica disponer de una técnica de IB muy ajustada y estandardizada para evitar al máximo los problemas asociados a una baja especificidad. Actualmente, dentro de los grupos de estudio en la Acción Concertada sobre la Borreliosis de Lyme de la Unión Europea (EUCALB) se está intentando definir criterios para la interpretación del IB. La formulación de un criterio único europeo se considera poco realista dadas las diferencias en la distribución de genoespecies y la incidencia en las zonas endémicas. A modo solamente orientativo, se muestran los criterios actualmente en estudio para España (Tabla 2, ref. 10). Sin embargo y mientras no se realice un estudio exhaustivo con sueros locales de casos que suelan presentar reacciones cruzadas, los criterios deben mantenerse tal y como están recomendados en las referencias 5 y 6 de la tabla 2, para asegurar que la especificidad no esté localmente disminuida por entidades clínicas diferentes de la BL.
La reactividad en IgM sólo es imprescindible para los casos de fase 1 (EM) y para los casos con enfermedad diseminada temprana, al comienzo de las manifestaciones neurológicas y articulares. Más adelante en el curso de la enfermedad, sólo se detectan, generalmente, niveles altos de IgG. Así mismo, el número de bandas positivas por IB-IgM puede decrecer con el tiempo en ausencia de tratamiento.

Reacciones cruzadas.

Las reacciones cruzadas descritas para este microorganismo y las detectadas en nuestro medio se muestran en la Tabla 3. Enfermos con anticuerpos frente a Micobacterium tuberculosis y Rickettsia conorii pueden presentar reactividad cruzada por ELISA, pero su reactividad por IB se limita a un pequeño repertorio de bandas que no confunden un diagnóstico.
Sin embargo, la reactividad en el IB de algunos casos de brucelosis (cuya forma neurológica puede dar lugar a confusión clínica y epidemiológica), fiebre recurrente (con una sintomatología neurológica que también comparte ciertos aspectos con la BL), sífilis, fiebre Q, bartonellosis o legionellosis sí son un problema importante de interpretación del bandeo de la prueba y por tanto, ante un IB reactivo en pacientes de zonas endémicas para estas infecciones, es fundamental descartar esta reactividad cruzada antes de evaluar su resultado. La información clínica es aquí importantísima. La reactividad cruzada con el Treponema pallidum es la más frecuentemente descrita y sólo la negatividad serológica de las pruebas de sífilis (treponémicas y reagínicas) avalarían el diagnostico de BL. El solo hallazgo de una prueba treponémica positiva no descarta de ninguna manera una BL, ya que se han descrito hasta un 43% de casos de borreliosis con reactividad cruzada frente a Treponema pallidum especialmente cuando se emplea FTA.
Una estimulación oligoclonal, como las observadas en casos de infección con virus Epstein-Barr, Citomegalovirus y Mycoplasma pneumoniae pueden producir una reactividad frente a un gran repertorio antigénico de B. burgdorferi..Así mismo, las reacciones autoinmunes que aparecen en casos de lupus eritematoso sistémico, artritis reumatoide, esclerosis múltiple y otros procesos con patogénias similares, pueden inducir reacciones falsas positivas, tanto por ELISA como IB, y generalmente de la clase IgM, por lo que se debe realizar un estudio de anticuerpos autoinmunes que descarten estas entidades clínicas.
En todo caso, la experiencia en el manejo e interpretación de un IB es lo más importante en el diagnóstico de la BL. Así mismo, los resultados serológicos positivos para esta enfermedad, deben siempre interpretarse a la luz de los datos clínicos y epidemiológicos y teniendo en cuenta la respuesta del paciente al tratamiento.

DIAGNOSTICO POR PCR

Dada la complejidad del diagnóstico serológico, la disponibilidad de datos objetivos adicionales es muy recomendable. Las técnicas de amplificación del genoma son de especial eficacia, pero tienen el problema de que una constante en esta enfermedad es el bajo número de organismos infectantes. La carga de espiroquetas transmitidas por el vector en el momento de la infección puede oscilar de unos cientos hasta 5.000 y el número de genomas en líquidos corporales puede ser menor de 50/ mL. En estas circunstancias es necesario, en primer lugar, disponer de técnicas de extracción y purificación de ADN que eviten al máximo la pérdida de material durante el procesamiento de la muestra. Para este objetivo, se han descrito una gran variedad de métodos dependiendo de la muestra a tratar. Los métodos tradicionales incluyen una disrrupción de las células, inactivación de RNasas y/o DNasas con sales caotrópicas, degradación de proteínas con proteinasa K, extracción del ADN con fenol-cloroformo y precipitación con alcoholes (etanol o isopropanol). Dado el bajo número de copias de genoma en las muestras, se han ensayado métodos alternativos que aumentan la sensibilidad. Entre ellos, la extracción con tiocianato de guanidina permite la extracción y precipitación sin cambiar de tubo, evitando la pérdida de material en los trasvases que se realizan en los métodos tradicionales. Otros métodos más simples aplicables a muestras líquidas realizan una centrifugación y posterior tratamiento por ebullición del sedimento, sin extracción posterior. En cualquier caso se recomienda la adición de "carriers" (glicógeno, ADN de leptospiras, etc.) que ayudan a precipitar pequeñas cantidades de ADN. También existen en el mercado procedimientos basados en matrices de resina que captan el ADN que será eluido a través de columnas desechables. Estos métodos que evitan el uso de disolventes pueden dar lugar a problemas de sensibilidad con Borrelia.
La técnica de amplificación también es vital a la hora de obtener una buena sensibilidad. Un test de PCR anidado, ("nested" o "semi-nested"), donde se realizan dos amplificaciones consecutivas mediante el uso del producto de la primera amplificación como diana para la segunda, proporciona una gran rendimiento. El procedimiento de detección de los amplificados también ayuda a mejorar la sensibilidad. Un método de detección ampliamente utilizado, con una gran sensibilidad y especificidad comprobadas por diferentes grupos, es el llamado "Reverse Line Blotting", donde los productos de amplificación, marcados con biotina (mediante el uso de uno de los iniciadores marcados) se hibridan sobre una membrana de nylon en la que se han aplicado sondas específicas de diferentes genoespecies. De esta manera, se obtiene un resultado positivo/negativo además de la genoespecie del organismo causal. La variabilidad en los genes elegidos para su amplificación es uno de los factores que introducen problemas de estandarización en este tipo de tests. La elección tiene que pasar obligatoriamente, por el empleo de regiones del genoma con poco grado de variabilidad. Se han descrito casi tantos métodos como genes específicos tiene el microorganismo. Los más utilizados son los que amplifican diversas regiones de ospA (en su zona menos variable), regiones de fla (flagelina), p93 (gen cromosómico con poca variabilidad) y los espacios intergénicos entre las unidades 5S y 23S del ADN ribosómico. En cualquier caso, ospA es, con diferencia, el gen más empleado y el que permite obtener resultados con una mayor sensibilidad.
Como resumen, una PCR que incluya una extracción con tiocianato de guanidina en un único tubo con glicógeno como "carrier" , amplificación de ospA de forma anidada y una detección de los amplicones mediante hibridación debe tener unos valores de sensibilidad muy buenos. Este tipo de técnicas, al alcance de cualquier laboratorio que disponga de las instalaciones para la realización de PCR, sin ninguna dificultad de interpretación serán el futuro para el diagnóstico de esta enfermedad y facilitarán, además, datos sobre las distintas genoespecies causantes de enfermedad humana ayudando a la producción de tests serológicos con mejores parámetros de sensibilidad y especificidad aunque será ya difícil disponer de técnicas serológicas que mejores significativamente el diagnóstico.

CULTIVO

En general el cultivo presenta una baja sensibilidad debido al bajo número de organismos infectantes. Este problema es mayor cuando se trata de aislar el microorganismo a partir de líquidos corporales, donde estos microorganismos están libres muy poco tiempo por la rapidez con que se adhieren a cualquier tejido. Un factor clave en esta técnica es la composición del medio de cultivo. La eficacia del medio más empleado, llamado BSKII, depende mucho de los controles de calidad durante su fabricación y de la estricta vigilancia de los productos que lo componen. Esta diferente capacidad de los médios de cultivo para la recuperación de Borrelia spp. implica que cualquier nuevo lote debe ser ensayado con cepas de crecimiento fastidioso. Existe ya un medio comercializado, pero el tiempo necesario para la obtención de un aislamiento (hasta 2 meses) y otros factores añadidos hacen suponer que esta técnica no sea útil ni fácil de incorporar a la rutina de laboratorios clínicos.
Manuscrito realizado íntegramente por el Dr. Pedro Anda.

LECTURAS RECOMENDADAS

1 Lyme neuroborreliosis. J.C. García-Moncó and J.L. Benach. Ann Neurol 1995; 37: 691-702.
2 European Union concerted action on risk assesment in Lyme borreliosis: clinical case definitions for Lyme borreliosis. Stanek G et al. Wien Klin Wochenschr 1996; 108: 741-747.
3 Western Blot assay for antibodies to Borrelia burgdorferi; Proposed guideline. NCCLS Document M34-P (ISBN 1-56238-354-X). NCCLS, 940 West Valley Road, suite 1400, Wayne, PA 19087-1898, USA, 1998.
4 Interpretation criteria for standardized western blots for three european species of Borrelia burgdorferi sensu lato. Hauser U et al. J Clin Microbiol 1995; 35: 1433-1444.
5 Immunoblot interpretation criteria for serodiagnosis of early Lyme disease. Engstrom et al. J Clin Microbiol 1995; 33: 419-427.
6 Western blotting in the serodiagnosis of Lyme disease. Dressler et al. J Infect Dis 1993; 167: 392-400.
7 PCR in the laboratory diagnosis of human Borrelia burgdorferi infections. Schmidt BL. Clin Microbiol Rev. 1997; 10: 185-201.
8 New method for the extraction of viral RNA and DNA from cerebrospinal fluid for use in the polymerase chain reaction assay. I Casas, Powell L, Klapper PE, Cleator GM.. J Virol Meth 1995; 53: 25-36
9 Simultaneous detection and genotyping of three genomic groups of Borrelia burgdorferi sensu lato in dutch Ixodes ricinus ticks by characterization of the amplified intergenic spacer region between 5S and 23rRNA genes. Rijpkema SGT et al. J Clin Microbiol 1995; 33: 3091-3095.7
Página Web de "European Union Concerted Action of LymeBorreliosis"http://www.dis.strath.ac.uk./vie/LymeEU/

Tabla 1. Resumen de criterios diagnósticos

Fase de la enfermedad	Sintomatología	RESULTADOS SEROLOGICOS	OTRAS EvidenciaS de laboratorio
Localizada temprana: afectación cutánea	Eritema Migrans	No esenciales. Poca sensibilidad de la serología	PCR positivo en biopsia
Diseminada temprana: Neuroborreliosis	Meningitis, meningoradiculitis parálisis facial	Producción intratecal de Ac. (pueden no producirse en neuritis craneal) Seroconversión IgG y/o IgM La IgM puede desaparecer	Pleocitosis linfocitaria en LCR (puede ser normal en casos de afectación del SN periférico) PCR positivo en LCR
Diseminada temprana: Artritis	Artritis recidivante con inflamación objetiva	Seroconversión IgG y/o IgM La IgM puede desaparecer	PCR positivo en LS
Diseminada temprana: Carditis	Bloqueo atrioventricular de grado II/III	Seroconversión IgG y/o IgM o Disminución de título
Diseminada tardía: Neuroborreliosis	Encefalitis encefalomielitis radiculomielitis	Producción intratecal de Ac. Títulos altos de IgG específica La IgM puede no detecartse	Pleocitosis linfocitaria en LCR (puede ser normal en casos de afectación del SN periférico) PCR positivo en LCR
Diseminada tardía: Artritis	Artritis crónica	Títulos altos de IgG específica (en suero y LS) La IgM puede no detecartse	PCR positivo en LS
Diseminada tardía: afectación cutánea	Acrodermatitis crónica atrophica	Títulos altos de IgG específica La IgM puede no detecartse	PCR positivo en biopsia

Tabla 2. Criterios de interpretación de un inmunoblot

	Refs. 5 y 6	Ref. 4	Ref. 4	Ref. 4	Ref. 10
Cepa utilizada	B. burgdorferi	B. burgdorferi	B. garinii	B. afzelii	B. burgdorferi
Bandas relevantes-IgG (en kD)	93*, 66, 58, 45, 41, 39, 30, 28, OspC**, 18	93, 58, 56, OspC, 21, 17	93, 39, OspC, 21, 17	93, 58, 43, 39, 30, OspC, 21, 17, 14	41, 39, OspC, 21, 17
Nº de bandas requeridas para un resultado + de IgG	5	1	1	2	2
Bandas relevantes-IgM (en kD)	41, 39, OspC	39, OspC, 17	39, OspC	39, OspC, 17	41, 39, OspC, 21, 17
Nº de bandas requeridas para un resultado + de IgM	2	1 (o reacción fuerte para 41)	1 (o reacción fuerte para 41)	1 (o reacción fuerte para 41)	2

* p93 = p83 = p100
** OspC = p23

Tabla 3. Resumen de reacciones cruzadas conocidas

ORGANISMO/ENFERMEDAD	ELISA	IB
M. tuberculosis	+	-
R. conorii	+	-
B. henselae	+	+/NC*
L. pneumophila	+	+/NC
T. pallidum	+	+/NC
fiebre recurrente	+	+/NC
EBV	+	+/NC
Artritis reumatoide	+	+/NC
LES	+	+/NC
Esclerosis múltiple	+	+/NC

* NC= No concluyente. La reacción positiva se aprecia en parte de los casos